Из генома - Группа Фошаньских горнодобывающих лабораторий, ООО

Биология связи, том 6, Номер статьи: 277 (2023) Цитировать эту статью

1242 Доступа

1 Цитаты

11 Альтметрика

Подробности о метриках

Расширение арсенала профилактических подходов против SARS-CoV-2 имеет первостепенное значение, особенно тех стратегий, которые устойчивы к антигенному дрейфу у Спайка. Здесь мы провели скрининг более 16 000 триггеров РНКи на геном SARS-CoV-2, используя массовый параллельный анализ для выявления гиперактивных миРНК. Мы выбрали десять кандидатов для проверки in vitro и обнаружили пять siRNA, которые проявляли сверхмощную активность (IC50 <20 пМ) и сильную блокаду инфекционности в экспериментах с живыми вирусами. Мы еще больше усилили эту активность за счет комбинаторного спаривания кандидатов siRNA и идентифицировали коктейли, которые были активны против нескольких типов вызывающих беспокойство вариантов (VOC). Затем мы исследовали более 2000 возможных мутаций в сайтах-мишенях siRNA с помощью насыщающего мутагенеза и подтвердили широкую защиту ведущего коктейля от будущих вариантов. Наконец, мы продемонстрировали, что интраназальное введение этого коктейля миРНК эффективно ослабляет клинические признаки и вирусные показатели заболевания на модели сирийского хомячка, являющейся золотым стандартом. Наши результаты открывают путь к разработке дополнительного уровня противовирусной профилактики, ортогонального вакцинам и моноклональным антителам.

Covid-19 стал одной из самых страшных пандемий в мире в наше время. Несмотря на то, что вакцины стали большим триумфом, существует острая необходимость расширить арсенал профилактических мер для устранения некоторых их недостатков1. Во-первых, практически все лицензированные вакцины нацелены на белок Spike2,3, сходясь в одной точке отказа, учитывая воздействие ускользающих мутантов и появление вирулентных вариантов4,5,6,7,8. Более того, поскольку все методы лечения моноклональными антителами (mAb) нацелены на этот же белок, такие антигенные сдвиги не только препятствуют защите вакцин, но также могут снизить эффективность широкого спектра других типов лечения. Во-вторых, многочисленные исследования показали, что защита вакцин, в том числе от тяжелых заболеваний, обычно ослабевает всего через несколько месяцев после второй9, третьей10,11 или четвертой дозы12. В-третьих, недавние данные, полученные на мышах и приматах, не являющихся человеком (NHP), позволяют предположить, что обновленные версии вакцин демонстрируют пониженную эффективность и могут быть подвержены первоначальному антигенному греху13,14, когда первое воздействие вируса определяет исход последующих воздействий. к антигенно родственным штаммам. Эти данные свидетельствуют об ограниченной полезности обновлений вакцин для новых вызывающих беспокойство вариантов (VoC). В-четвертых, противовирусные препараты, такие как Паксловид, не смогли защитить взрослых от воздействия COVID-19. Наконец, несколько исследований неизменно показывают, что добиться высокой защиты у лиц с ослабленным иммунитетом сложно, даже после многократного введения15, а это означает, что люди, которые больше всего нуждаются в вакцине, с наименьшей вероятностью получат от нее пользу. Наконец, инфекции у лиц с ослабленным иммунитетом могут иметь длительную продолжительность16,17, что увеличивает риск гиперэволюции и появления VoC, создавая тем самым серьезные риски для общественного здравоохранения.

Опираясь на успех многочисленных предыдущих исследований, в которых малые интерферирующие РНК (миРНК) эффективно использовались в качестве противовирусных средств18,19,20,21, мы предположили, что интраназально вводимые миРНК будут особенно хорошо подходить в качестве меры усиления вакцинации при инфекциях, верхние дыхательные пути, где их можно использовать для смягчения передачи инфекции.

С этой целью мы проверили более 16 000 триггеров РНК-интерференции (РНКи), нацеленных на геном SARS-CoV-2, чтобы выявить сверхактивных кандидатов. Скрининг основывался на массовом параллельном анализе Sens.AI, который использует систему синтетической биологии для повторения подавляющей активности каждого кандидата миРНК против вируса. В наших предыдущих исследованиях22,23 мы использовали более раннюю версию Sens.AI для выявления гиперактивных миРНК против ВИЧ и ВГС. Однако предыдущий проект был неэффективным, на его реализацию ушло более 6 месяцев. В новом проекте мы изобрели более быстрый метод, который улучшает соотношение сигнал/шум за счет использования статистического обучения вместо трудоемких экспериментальных шагов. Обширный компьютерный анализ и эксперименты in vitro позволили получить коктейль из двух гиперактивных кандидатов на миРНК, который оказался эффективным против всех протестированных вирусных штаммов. Окончательно. эффективность интраназального введения этого коктейля миРНК была подтверждена на модели SARS-CoV-2 у сирийских хомяков.

1.4uM). Overall, these results show that our novel genome-wide screening method identifies hyper-potent siRNAs within a single cycle./p>95%. Interestingly, both S8 and S10 showed weak responses, at the level of ~10% SARS-CoV-2 inhibition compared to the control siRNA, despite very high potency in the reporter assay (IC50 < 20 pM). However, unlike the other siRNA candidates, these two target the virus's negative strand, which is an intermediary in the replication process. Therefore, we hypothesised that targeting this intermediary RNA molecule likely would not interfere with viral replication. To further confirm our top candidates, we assessed the effect on live virus infectivity in cells using TCID50 assay (Fig. 3b). Again, we found a strong inhibitory activity of the top three out of four siRNAs, with viral repression exhibiting approximately two orders of magnitude compared to the GFP siRNA control. We next used the same settings to test five of the most potent siRNAs from the open-source discovery method (Supplementary Table 3). Only one candidate, Hel14, displayed repression levels of the viral load by >95%, on par with the levels exhibited by the top siRNAs from our Sens.AI screen (~90% inhibition) (Fig. 3c)./p>95% repression) (Fig. 3f). Interestingly, S5 was tolerant and showed efficacy against the Delta strain despite the fact that it possesses a mutation in position 14 of its target site. Second, we tested the S5/Hel14 cocktail against Omicron BA.1 using a similar setting. Similar to other reports33, the Omicron variant did not replicate as fast as other VoCs in vitro. Since these lower replication rates reduced the dynamic range of our assays, we added two positive controls, chloroquine and molnupiravir, both of which demonstrated as potent inhibitors of Omicron BA.1. The activity of the S5/Hel14 cocktail was indeed diminished in the Omicron variant. Nevertheless, it inhibited viral replication to a similar level as was induced by the positive control treatments (Fig. 3g). This finding suggested that the more modest inhibition was likely the result of a lower dynamic range due to slow viral replication, rather than due to reduced potency of the RNAi cocktail itself. Finally, we tested the activity of the cocktails against our novel replicon system, which recapitulated the function, but not infectivity of the Beta SARS-CoV-2 strain34. Consistently, the cocktails repressed the replicon by 10-15 fold, indicating that they confer a robust inhibition profile across diverse VoCs34. Importantly, analysis of high throughput sequencing data showed that cells that were treated with the S3/S5 cocktail exhibited a specific profile of depletion of reads at the siRNA cleavage sites (Fig. 3h). These data provide mechanistic support to confirm that the observed reduction in viral load was directly related to siRNA silencing./p>51% reduction in this score. Based on previous studies, the former mutation type is seven times more common than the latter36, suggesting that S5 could tolerate to some extent the more prevalent type of double mutations in the target site./p>7% weight loss at Day 5 postinfection, consistent with previous studies38,39,40. The siRNA-treated group benefited from significant protection against weight loss compared to this negative control group (p < 0.05; bootstrap hypothesis testing and Bonferroni adjusted) (Fig. 5b). This weight loss was statistically indistinguishable from the positive control group that was treated with bamlanivimab. In addition, we observed an order of magnitude suppression of viral load in the lungs of the active treatment group (Day 5) compared to the negative control, as measured by qPCR measurement of the RdRP gene (ΔVLlung = 10.3x, plung < 0.001; bootstrap hypothesis testing and Bonferroni adjusted) (Fig. 5c). Similarly, we also observed a significant suppression, albeit to a lesser extent, of viral load in the nares (ΔVLlung = 2.5x, plung < 0.05; bootstrap hypothesis testing and Bonferroni adjusted) (Fig. 5d). In both cases, the antibody was more effective than the siRNA treatment, suggesting that additional dose optimization studies are required in order to fully develop the siRNA cocktail into a viable prophylactic./p>